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本试剂盒是一款专门针对细胞培养中支原体污染的检测试剂盒，使用荧光PCR探针法检测至少125种支原体。检测包括发酵支原体(M.fermentans)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.oral)、精氨酸支原体(M.arginini)、鸡毒支原体(M.gallisepticum)、肺炎支原体(M.pneumonia)、滑液支原体(M.synoviae)等104种Mycoplasmas；莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)等5种Acholeplasmas；解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)等3种Ureaplasmas和13种Spiroplasmas，与环境中常见菌如肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、沙雷菌、沙门菌、乳酸菌、念珠菌、曲霉菌等均无交叉反应。

试剂盒分为直扩法和提取法两种操作方法。直扩法使用简便，无需支原体DNA的提取，直接取1μL细胞培养液和1μL酶液加入到反应体系中即可上机检测。整个实验在一个半小时内完成。提取法可最大限度的检测到支原体的存在，灵敏度极高，对于常见支原体，如发酵支原体(M.fermentans)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.oral)、精氨酸支原体(M.arginini)、无乳支原体(M.agalactiae)、牛支原体(M.bovis)、鼠肺支原体(M.pulmonis)等均可达到5 CFU/mL的检出浓度。

本制品适用于各种悬浮、贴壁培养细胞，包括CHO、Vero、NS0、SP2/0、Sf9、293、HeLa等，且具有广泛的培养基兼容性。可为生物制药企业和科研院校提供简单、快速、可靠的支原体检测实验。

• 直扩法
  
  • 待测样本的准备：待测的细胞培养液最好选用培养三天以上且汇合度在70%以上的细胞培养上清(贴壁细胞)，无需离心。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后培养3天以上进行检测，直接取培养液即可，也无需离心。
    
  • 反应体系的配制：将试剂盒从冰箱取出，待融化后，震荡混匀。根据待测样本数量在离心管中按如下体系配制，并震荡混匀后以49μL分装到荧光PCR管中。
    

    成分	单次反应体积	N次反应体积
    Mycoplasma Detector Mix	39μL	39×1.1N
    Mycoplasma Detector Enzyme	1μL	1×1.1N
    ddH2O	9μL	9×1.1N

  • 加样：在一只分装后的PCR管中加入1μL无模板水作为阴性对照，在另一只分装后的PCR管中加入1μL Positive Control作为阳性对照，其余的荧光PCR管均加入1μL待检测的培养液作为检测孔。
• 提取法
  
  • 待测样本的准备：用支原体DNA提取试剂盒提取待测的细胞培养液。(建议最后用20～30μL的洗脱液洗脱DNA)
    
  • 反应体系的配制：将试剂盒从冰箱取出，待融化后，震荡混匀。根据待测样本数量在离心管中按如下体系配制，并震荡混匀后以40μL分装到荧光PCR管中。
    

    成分	单次反应体积	N次反应体积
    Mycoplasma Detector Mix	39μL	39×1.1N
    Mycoplasma Detector Enzyme	1μL	1×1.1N

  • 加样：在一只分装后的PCR管中加入10μL无模板水作为阴性对照，在另一只分装后的PCR管中加入1μL Positive Control和9μL无模板水作为阳性对照，其余的荧光PCR管均加入10μL提取好的DNA作为检测孔。
• 上机反应
  将PCR管放入荧光PCR仪中，打开参数窗口设置循环条件，反应程序如下表所示：
  

  阶段	温度	时间	是否检测荧光 (FAM和VIC)	循环数
  UNG酶水解	50℃	2min	否	1
  预变性阶段	95℃	10min	否	1
  扩增及荧光 收集阶段	95℃	10sec	否	40
  	60℃	30sec	是
  降温阶段	25℃	1min	否	1

  • 试剂的配制和模板的加样要在不同的区域操作，避免污染，实验结束后的PCR管切勿开盖，应包裹好后处理掉。
• 结果判定
  本制品的支原体检测结果参考FAM荧光曲线的Ct值。VIC荧光曲线为内标曲线。实验结束后，按下列步骤分析和判断：
  
  • 阳性对照：FAM和VIC通道应均有扩增曲线，FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值≤34，且呈现明显的扩增曲线。
    
  • 阴性对照：FAM通道检测无扩增曲线，VIC通道Ct值≤34。
    
  • 样本的检测结果判断：当满足上述阳性对照和阴性对照的检测结果后看样本检测孔FAM的Ct值。当FAM的荧光曲线Ct值≤36时为阳性结果。当FAM的荧光曲线Ct值＞36且内标VIC的Ct值≤34时为阴性结果。
  • 当样本检测孔FAM的荧光曲线扩增Ct值较小时VIC荧光曲线可以不起峰，此时样本为阳性。